二氧化碳培养箱灭菌方法

二氧化碳培养箱水托盘加硫酸铜方法

  配制方法：20g无水硫酸铜＋5ml浓硫酸＋1L高压过的双蒸水

  配制饱和硫酸铜溶液 

 细胞间*消毒

       1．熏蒸无菌间，甲醛加高锰酸钾即可，一般72小时后开门通气。

       2．用0.5%新洁尔灭擦拭超净台和墙壁，确保不留死角，地面用新洁尔灭消毒液拖地。

       3．75%酒精对无菌间的所有物品进行消毒，包括孵箱内。

       4．紫外灯，空气净化器打开至少4h以上，紫外灯可以过夜。

       目前，控制水盘内污染的方法有如下几种：

       1、 定期(至少每两周一次)，更换水盘内的无菌蒸馏水或无菌去离子水。

       2、 在水盘内添加适量硫酸铜，配制方法：20g无水硫酸铜＋5ml浓硫酸＋1L灭菌纯水。

       3、 夏季气温高时，水盘里加0.02％的叠氮钠可以有效的预防真菌污染。

       4、 水盘内添加适量抗生素。

       5、 定期为二氧化碳培养箱（含水盘）进行一次高温灭菌。

       对付霉菌通常用饱和的硫酸铜溶液，放在培养箱的装水盘中，细胞房的空调要用除湿的功能。如果不幸染上，要用84液擦培养箱，再用75%酒精擦。

 灭菌操作：

 在无菌箱内每立方米用甲醛8—10毫升，高锰酸钾5克，熏蒸45分钟后接种

 在无菌箱中每立方米用甲醛8－10毫升、高锰酸钾0.25千克，熏蒸45分钟后接种，栽培种接种量按每瓶二级种接30－40袋为宜。

 （一）常用消毒剂

       现将常用的药品及其配制、使用方法，介绍如下：

    1． 35％甲醛水溶液（HCHO）：又名福尔马林，使蛋白质变性。用于培养室、无菌室的灭菌。

 　2．0.1％的升泵水（HgCL3）：能使蛋白质变性，抑制酶类。0.1％升泵配制方法是称取升泵0.1克，    用少许酒精溶解，再加水至100毫升即成。用于无菌箱、二氧化碳培养箱、培养皿四周表面以及手指的灭菌。

　3．石炭酸（C6H5OH），5％浓度喷雾后，能使蛋白变性沉淀。石炭酸（苯酚）50毫升，加水950毫升配成。用于 工作服、实验桌的灭菌。杀菌效果同升泵。

4．高锰酸钾（KMnO4）：氧化剂。0.1％浓度能使蛋白质与氨基酸氧化，失去酶的活性，用于消毒，能抑制或杀死 杂菌。

　5．乙醇（CH3CH3OH）：又称酒精。消毒以75％浓度的效果好。它能使蛋白质脱水变性。高浓度酒精会使蛋白质很快脱水凝固，消毒作用反而减弱。

　 6．新洁尔灭：0.25％新洁尔灭用于无菌箱、无菌室的灭菌。一般新洁尔灭5％原液50毫升；加水950毫升配成。

　7．漂白粉水：取漂白粉10克，加水140毫升配成。通常在使用前临时配制，静置1～2小时，取上清液喷射，进 行室内消毒，每平方米用1升。

　8．药皂：煤酚皂、硼酸皂等各种药皂的水溶液，均可用于器具、橡皮塞及手指的消毒。

 9．2％硫酸铜溶液：用硫酸铜（胆矾）2克，加水至 100毫升加热溶解配成。用于床架、木架等各种菌种架的消 毒。还可用5％硫酸铜溶液。

10．0.5％波尔多液：先用硫酸铜1斤，溶于100斤水， 再用石灰1斤，加水100斤。然后等量混合起来即成。用于菌种架、段木的消毒。

 11.多菌灵：用于杀灭真菌、半知茵。1：800倍拌料或 1：500倍喷洒均可。

       （二）无菌箱及无菌室的消毒灭菌

       无菌箱的消毒灭菌，可采取以下几种方法：

       1．用甲醛和高锰酸钾混合熏蒸：一般每平方米需40％甲醛10毫升、高锰酸钾8毫升，进行熏蒸。使用时，先密闭门窗，量甲醛溶液盛入容器中、然后倒入量好的高锰酸钾，人员随之离开接种室，关紧房门，熏蒸20—30分钟即可。

       2．0.1％升泵水消毒：用0.1％升泵水浸过的纱布或海绵进行指擦，或用喷雾器喷雾灭菌，使箱内的上下左右都沾上升泵水，手也可用升泵水消毒，并把袖子卷起来。喷雾后 20～30分钟，箱内的杂菌和雾滴一起落到箱底被杀死，内部的空气就变得很清洁。

　　 3．紫外线照射灭菌：在无菌箱中装一支200伏、3O瓦的紫外线灯管；每次开20～30分钟，就能达到空间杀菌的 目的。照射结束后，罩黑布半小时，以增强杀菌效果。

　　 4．石炭酸喷雾：在每次接种之前，用5％石炭酸溶液喷雾，可促使空气中的微粒和杂菌沉降，防止桌面微尘飞扬，并有杀菌作用。

　　 5．石灰揩擦：经常用药物熏蒸，易造成酸性环境，特别用甲醛和高锰酸钾熏蒸长久，污染往往越来越严重，预防办法可把各种药品交替使用，过一段时间（约五周）用石灰擦洗一遍。实践证明，这样做效果很好。

 无菌室消毒同无菌箱。

      三）无菌室的使用规程

　　 无菌室无固定程序，但按一般操作应遵循如下规程：

　   1．接种室内和缓冲室内使用前，用5％石炭酸溶液喷雾。把所需要的器材搬入缓冲室清洗，等晒干后搬入接种 室，打开紫外线灯，照射杀菌。

　　2．穿上工作服及无菌工作帽、鞋，然后用煤皂液洗手2 分钟。进人接种室后，查验器械是否放在一定位置。然后用 5％石炭酸溶液重点在工作台的上方和附近的地面上喷雾。然后退回缓冲室。还可给接种室门口地面洒一层石灰，进门时踩石灰可使鞋底保持无杂菌状态。

　    3．接种操作前，用70％的酒精棉球擦手。进行无菌操作时，要严格认真，动作轻捷，尽量减少空气流动。

　　 4．工作结束后，立即将台面收拾干净，不留残物。然后用5％石炭酸全面喷洒。

　　5．操作时，注意安全。如棉塞着火，用手紧握即可熄灭。如打破菌瓶，可用抹布沾5％石炭酸，收拾到废物桶 内。每次的污染物应小心放在盘内，盖严拿出室外深埋或烧掉。

　　（四）无菌室空气污染情况的检验

　　 定期检验无菌室空气污染情况，对改进灭菌措施，提高成品率是非常必要的。常用方法步骤如下：

　　 1．平板检验法：用常规培养基，倒成平板，收入接种室。在事先熏蒸好的接种室，使用前半小时或1小时把供试的培养皿或试管打开，按预定时间盖好培养皿或试管。留对照皿不打开。然后一起放入30℃的温箱中培养48小时，检查有无菌殖生长，并由菌落形态，判断杂菌种类。一般要求平板培养基开盖5分钟，菌落不超过3个；叙面培养基开塞 30分钟者，以不出现菌落为合格。

　　 2．斜面检验法：将常用的琼脂斜面培养基各取二管， 放入接种室，按无菌操作各将其中的一管的棉塞取出，放在灭菌的培养皿内。经过一定时间后，再将棉塞通过火焰，塞回试管，连同对照一起培养。经48小时后，检验无杂菌生长。和上边方法同。

　　 3．空气污染情况检验：在接种过程中，人员的出过、器材的搬放、接种操作的动作等原因造成空气污染，检验方法是在准备工作结束后，接种操作开始时，按上述方法打开培养皿盖子或试管塞，经5分钟、30分钟或直到工作结束时再盖好，以检验在不同的使用时间内，空气污染的程度。

　　 如霉菌较多时；可先用5％石炭酸全面喷射后，再用甲醛熏蒸。如细菌较多时，可采取用乳酸和甲醛交替熏蒸的办法加以杀灭。